IGF-1 LR3 liofiliziran,The freeze-dried long-acting insulin-like growth factor-1 LR3 formulation uses low-temperature vacuum drying technology to remove moisture, preventing peptide degradation or aggregation in liquid formulations and extending the shelf life (usually up to 2 years at -20 ℃). It can be directly used after reconstitution, reducing transportation and storage costs. At the same time, the freeze-drying process can remove impurities and improve the purity of the formulation (usually>95%). Međutim,-dugotrajna upotreba može dovesti do desenzibilizacije receptora i zahtijevati povremenu primjenu. Visoke doze mogu uzrokovati hipoglikemiju i potrebno je pratiti razinu glukoze u krvi.
Ne nudimo samo čisti prah i kapsule, već i druge oblike doziranja. Ako je potrebno, kontaktirajte naš prodajni tim.
Naši proizvodi iz
IGF-1 LR3 COA
Kloniranje gena i konstrukcija vektora ekspresije
Dizajn genaIGF-1 LR3 liofiliziranzasniva se na sekvenci prirodnog IGF-1, ali sa sljedećim ključnim modifikacijama:
Proširenje N-terminala: Dodajte 13 aminokiselina (MFPAMPLSSLFFN) na N-kraj IGF-1 da produžite njegov poluvijek i poboljšate njegovu biološku aktivnost.
Zamjena aminokiselina: Zamijenite glutaminsku kiselinu (Glu) na poziciji 3 IGF-1 argininom (Arg), tj. R3 modifikacijom, da smanjite sposobnost vezivanja sa IGFBP i povećate slobodnu koncentraciju.
sinteza gena
Dobijte fragment ciljanog gena putem hemijske sinteze ili PCR amplifikacije na osnovu dizajnirane sekvence gena IGF-1 LR3. Hemijska sinteza obično usvaja tehnologiju sinteze u čvrstoj fazi, postepeno dodajući nukleotide i na kraju sintetizirajući kompletne fragmente gena. PCR amplifikacija koristi poznate sekvence IGF-1 za dizajniranje prajmera i amplifikaciju ciljnog gena putem PCR reakcije.
Odabir odgovarajućeg ekspresijskog vektora je ključni korak u ekspresiji proteina. Uobičajeni ekspresijski vektori uključuju pET serije (kao što je pET30a), pGEX serije, itd. Ovi vektori imaju efikasne promotere, višestruka mesta kloniranja i sekvence oznaka (kao što su His oznake), koje olakšavaju naknadno prečišćavanje i detekciju proteina.
Na primjer, koraci konstrukcije vektora ekspresije pET30a su sljedeći:
Enzimsko cijepanje: Koristite restrikcijske endonukleaze kao što su BamHI i XhoI da izvršite dvostruko cijepanje enzima na pET32a vektoru i fragmentu gena IGF-1 LR3, stvarajući komplementarne ljepljive krajeve.
Veza: Enzim digestiran vektor i genski fragment povezani su T4 DNK ligazom da formiraju rekombinantni ekspresijski vektor pET32a-LR3-IGF1.
Transformacija: Transformirajte rekombinantni ekspresijski vektor u kompetentne ćelije E. coli (kao što je DH5) i dobijte pozitivne klonove kroz skrining antibiotika (kao što je ampicilin).
Identifikacija: Potvrdite ispravnost rekombinantnog ekspresijskog vektora metodama kao što su PCR kolonija, identifikacija enzimske digestije ili sekvenciranje.
Ekspresija proteina
Odabir ekspresionih sojeva
Odabir odgovarajućeg soja za ekspresiju je ključan za ekspresiju proteina. Obično korišćeni ekspresioni sojevi uključuju Rosetta (DE3), BL21 (DE3) itd. Ovi sojevi imaju efikasne T7 RNA polimerazne sisteme i mogu efikasno da eksprimiraju gene koje pokreće T7 promotor.
Uzimajući Rosettu (DE3) kao primjer, njene karakteristike uključuju: sadrži gen T7 RNA polimeraze, induciran ekspresijom IPTG. Noseći rijetke kodonske tRNA gene mogu efikasno eksprimirati egzogene gene koji sadrže rijetke kodone. Pogodno za ekspresiju toksičnih proteina ili teško ekspresnih proteina.
Optimizacija uslova ekspresije
Uslovi ekspresije proteina, kao što su koncentracija induktora, temperatura indukcije, vreme indukcije, itd., imaju značajan uticaj na prinos i kvalitet proteina. Optimizacijom uslova ekspresije može se povećati nivo ekspresije IGF-1 LR3.
Koncentracija indukcionog agensa: IPTG je uobičajeno korišćeni induktor, sa koncentracijom tipično između 0,1-1 mM. Odredite optimalnu koncentraciju IPTG kroz eksperimente s gradijentom kako biste postigli najviši nivo ekspresije proteina.
Temperatura indukcije: Temperatura indukcije se obično bira između 16-37 stepeni. Niže temperature (kao što je 16-20 stepeni) mogu pomoći u smanjenju razgradnje proteina i formiranju inkluzijskih tijela, te povećati prinos rastvorljivih proteina.
Vrijeme indukcije: Vrijeme indukcije je obično između 2-24 sata, a optimalno vrijeme indukcije određuje se analizom nivoa ekspresije proteina kroz vremensko uzorkovanje.
Detekcija ekspresije proteina
IzrazIGF-1 LR3 liofiliziranotkriveno je SDS-PAGE i Western blot metodama.
SDS-PAGE: Prikupite bakterijske uzorke prije i nakon indukcije, izvršite ultrazvučnu fragmentaciju ili hemijsku lizu, centrifugirajte da odvojite supernatant i precipitat i izvršite SDS-PAGE analizu zasebno. Poređenjem promjena proteinskih traka u supernatantu i precipitatu prije i nakon indukcije, potvrđena je ekspresija IGF-1 LR3.
Western blot: Koristite specifična antitijela (kao što su antitijela na His tag ili anti IGF-1 antitijela) da izvršite imunoblot analizu na SDS-PAGE odvojenim proteinima da dodatno potvrdite ekspresiju i molekularnu težinu IGF-1 LR3.
Protein Purification
Bakterijska liza
Sakupite inducirane bakterijske stanice i lizirajte ih kako bi se oslobodili intracelularni proteini. Uobičajene metode pucanja uključuju ultrazvučnu fragmentaciju, homogenizaciju pod visokim-pritiskom, hemijsko pucanje, itd. Uzimajući ultrazvučnu fragmentaciju kao primjer, koraci su sljedeći:
Sakupljanje bakterija: Centrifugirajte bakterijsku otopinu izazvanu ekspresijom kako biste prikupili bakterijske stanice i resuspendirajte ih u puferu za lizu (kao što je PBS ili Tris HCl pufer).
Ultrazvučna fragmentacija: Bakterijska suspenzija se stavlja u ledenu kupku i drobi pomoću ultrazvučnog disruptora, obično koristeći kratkoročnu{0}}metodu višestruke fragmentacije (kao što je svaki put 10 sekundi, interval od 10 sekundi, ponavlja se 10 puta) kako bi se izbjegla denaturacija proteina zbog pregrijavanja.
Centrifugalno odvajanje: Centrifugirajte zdrobljenu bakterijsku suspenziju da biste odvojili supernatant i talog. Supernatant sadrži topljive proteine, dok talog može sadržavati inkluzijska tijela ili ćelijske ostatke.
Afinitetna hromatografija
Zbog činjenice da rekombinantni IGF-1 LR3 tipično nosi His oznaku, može se pročistiti pomoću afinitetne hromatografije s jonima nikla (Ni NTA).
Priprema kolone: Ubacite Ni NTA pakovanje u kolonu za hromatografiju i uravnotežite ga puferom za ekvilibraciju (kao što je PBS koji sadrži 20 mM imidazola).
Punjenje uzorka: Ubacite supernatant bakterijskog lizata na kolonu za hromatografiju, omogućavajući IGF-1 LR3 sa His oznakom da se veže sa jonima nikla.
Ispiranje: Isperite kolonu za hromatografiju puferom za ispiranje (kao što je PBS koji sadrži 50 mM imidazola) da biste uklonili nevezane ili slabo vezane proteine nečistoće.
Eluiranje: Koristite pufer za eluiranje (kao što je PBS koji sadrži 250 mM imidazola) da eluirate IGF-1 LR3 vezan za hromatografsku kolonu i sakupite eluent.
Desalinizacija i koncentracija
Otopina IGF-1 LR3 nakon eluiranja sadrži visoku koncentraciju imidazola, koju je potrebno ukloniti desalinizacijom i koracima koncentracije kako bi se povećala koncentracija proteina.
Desalinizacija: Koristite kolonu za desalinizaciju ili vrećicu za dijalizu da uklonite imidazol iz eluenta i zamijenite ga odgovarajućim puferskim rastvorom (kao što je PBS).
Koncentracija: Koncentrirajte desalinizirani proteinski rastvor koristeći ultrafiltracione cijevi ili centrifugalne koncentratore kako biste povećali koncentraciju proteina na željeni nivo.
Ispitivanje čistoće i aktivnosti
Čistoća i aktivnost prečišćenog IGF-1 LR3 detektovani su SDS-PAGE, HPLC ili ELISA metodama.
SDS-PAGE: Analizirajte čistoću pročišćenog proteina i potvrdite da nema očiglednih nečistoća.
HPLC: Koristite HPLC reverzne faze ili HPLC sa isključenjem veličine za dalju analizu čistoće i distribucije molekulske težine proteina.
ELISA: Enzimski imunosorbentni test (ELISA) se koristi za otkrivanje biološke aktivnosti IGF-1 LR3, a nivo njegove aktivnosti se odražava stepenom vezivanja za specifična antitijela.
Proces sušenja zamrzavanjem
Princip sušenja zamrzavanjem
Liofilizacija je tehnika sušenja koja uklanja vlagu kroz nisko{0}}smrzavanje i sublimaciju pod vakuumom. Proces sušenja zamrzavanjem{2}} uključuje tri faze: prethodno zamrzavanje, sublimacijsko sušenje i desorpciono sušenje, što može maksimizirati aktivnost i stabilnost proteina.
Koraci sušenja zamrzavanjem
Podijelite pročišćeni rastvor IGF-1 LR3 u boce za sušenje zamrzavanjem ili boce s penicilinom i stavite ih u zamrzivač za sušenje zamrzavanjem da se prethodno zamrznu ispod -40 stepeni kako bi se otopina potpuno zamrznula.
Postepeno podižite temperaturu na oko -20 stepeni u uslovima vakuuma, omogućavajući ledu da se sublimira direktno u vodenu paru i ukloni većinu vlage. U ovoj fazi, potrebno je kontrolisati brzinu zagrijavanja i stepen vakuuma kako bi se izbjegla denaturacija ili kolaps proteina.
Dalje podignite temperaturu na 20-30 stepeni da biste uklonili preostalu vlagu i smanjili sadržaj vlage u zamrznutom proizvodu na ispod 1%. U ovoj fazi potrebno je održavati visok stepen vakuuma kako bi se osiguralo potpuno uklanjanje vlage.
Nakon što je sušenje završeno, brzo zatvorite{0}}bocu za sušenje zamrzavanjem ili bocu s penicilinom kako biste spriječili ponovni ulazak vlage.
Zaštita od sušenja smrzavanjem
Da biste zaštitili aktivnost i stabilnost IGF-1 LR3 tokom sušenja-liofilizacijom, obično je potrebno dodati{5}}zaštitna sredstva za sušenje zamrzavanjem. Uobičajena sredstva za zaštitu od sušenja smrzavanjem uključuju:
- Ugljikohidrati: kao što su alginat, saharoza, glukoza, itd., mogu formirati staklaste strukture i stabilizirati konformaciju proteina.
- Polimeri kao što su polietilen glikol (PEG) i polivinilpirolidon (PVP) mogu povećati viskozitet rastvora i smanjiti agregaciju proteina.
- Aminokiseline, kao što su glicin i alanin, mogu djelovati kao donori ili akceptori vodonične veze, stabilizirajući strukturu proteina.
- Surfaktanti kao što su Tween 20, Tween 80, itd. mogu smanjiti adsorpciju proteina na zidove posude i poboljšati stope oporavka.
Uzimajući trehalozu kao primjer, njena količina dodatka je obično 1-10 puta veća od mase proteina, koji može formirati zaštitni sloj tokom sušenja zamrzavanjem kako bi spriječio denaturaciju proteina.
Optimizacija procesa sušenja zamrzavanjem
Optimizacija procesa{0}}leofilizacije je ključna za poboljšanje kvalitetaIGF-1 LR3 liofiliziran. Podešavanjem parametara kao što su temperatura pred smrzavanje, temperatura sublimacionog sušenja, analitička temperatura sušenja i stepen vakuuma, može se postići najbolji efekat-sušenja zamrzavanjem.
Temperatura prije smrzavanja
Temperatura prije zamrzavanja trebala bi biti niža od eutektičke točke proteina kako bi se osiguralo potpuno zamrzavanje otopine. Obično se biraju temperature ispod -40 stepeni.
Temperatura sušenja sublimacijom
Temperatura sušenja sublimacijom trebala bi biti niža od temperature kolapsa proteina kako bi se izbjegla denaturacija proteina ili kolaps posude. Obično se bira oko -20 stepeni.
Analiza temperature sušenja
Temperatura sušenja za analizu treba da bude viša od temperature sublimacionog sušenja kako bi se uklonila zaostala vlaga. Obično se bira 20-30 stepeni.
Stepen vakuuma
Stepen vakuuma treba održavati na niskom nivou (npr<100 mTorr) to promote the sublimation and removal of moisture.
Popularni tagovi: igf-1 lr3 liofilizirani, Kina igf-1 lr3 liofilizirani proizvođači, dobavljači, IGF 1 LR3 krema, Injekcija ipamorelina, MT2 injekcija, Sermorelin acetat u prahu, Sermorelin tableta, Injekcija tesamorelin peptida
